Les altérations des globules rouges des poissons des cavernes fournissent des preuves d'adaptation à l'oxygène souterrain réduit

Scientific Reports volume 12, Numéro d’article: 3735 (2022) Citer cet article

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Les animaux vivant dans des environnements extrêmes offrent la puissante opportunité d’examiner l’évolution adaptative en réponse à diverses pressions. L’une de ces pressions est la réduction de l’oxygène, généralement présente dans les environnements souterrains et de haute altitude. Les animaux cavernicoles doivent également faire face à l’obscurité et à la famine, qui ont toutes deux été rigoureusement étudiées en tant que forces clés de l’évolution des traits associés aux cavernes. Fait intéressant, l’hypoxie en tant que pression environnementale a reçu moins d’attention. Ici, nous avons examiné des phénotypes supposément adaptatifs évoluant chez un poisson téléostéen d’eau douce, Astyanax mexicanus, qui comprend à la fois des formes de surface et des cavernes. Ce système modèle offre également la possibilité d’identifier des réponses convergentes à l’hypoxie, en raison de la présence de nombreuses populations de grottes naturelles et colonisées indépendamment, aux côtés de conspécifiques de surface étroitement apparentés. L’objectif de cette étude est l’hémoglobine, une molécule essentielle pour le transport et l’administration de l’oxygène. Nous avons constaté que plusieurs populations de grottes abritent une concentration plus élevée d’hémoglobine dans leur sang, ce qui coïncide avec une augmentation de la taille des érythrocytes de morphe des cavernes par rapport aux poissons de surface. Fait intéressant, les morphes de grotte et de surface ont un nombre comparable d’érythrocytes par unité de sang, ce qui suggère qu’un taux élevé d’hémoglobine n’est pas dû à une surproduction de globules rouges. Alternativement, en raison d’une augmentation de la surface cellulaire des érythrocytes chez les poissons des cavernes, nous pensons qu’ils contiennent plus d’hémoglobine par érythrocyte. Ces résultats soutiennent l’idée que les poissons des cavernes se sont adaptés à l’hypoxie dans les grottes par la modulation de la production d’hémoglobine et de la taille des érythrocytes. Ce travail révèle une caractéristique adaptative supplémentaire du poisson cavernicole Astyanax et démontre que des changements coordonnés entre l’architecture cellulaire et les changements moléculaires sont nécessaires pour les organismes évoluant sous une pression environnementale intense.

Notre compréhension des interactions complexes entre les conditions environnementales extrêmes et la réponse des organismes à ces pressions reste incomplète. Un modèle naturel puissant pour étudier l’adaptation dans des environnements extrêmes est le poisson cavernicole mexicain aveugle, Astyanax mexicanus (Fig. 1a). Cette espèce permet des comparaisons directes de deux morphotypes existants, un morphe de « surface » vivant dans la rivière et des morphes souterrains obligatoires de « grotte ». Trente populations de grottes existantes1 sont réparties dans des réseaux de grottes souterraines dans le karst calcaire exposé de la région de la Sierra de El Abra au nord-est du Mexique (Fig. 1a). Des changements phénotypiques ont accompagné cette transition de la surface à la grotte, sur une période estimée de ~ 20 à 500 000 ans2,3, y compris la perte des yeux, la pigmentation et l’amélioration des sens non visuels. Au cours des 8 décennies qui se sont écoulées depuis leur découverte4, des progrès considérables ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes sous-jacents aux caractéristiques régressives, mais les pressions environnementales du système karstique El Abra ont principalement examiné les effets d’une lumière et d’une nutrition limitées5.

Les populations multiples de poissons cavernicoles Astyanax mexicanus ont des concentrations plus élevées d’hémoglobine que les poissons de surface. Astyanax mexicanus se compose de morphotypes de grottes et de surfaces. Les morphes de grottes sont répartis dans de nombreuses grottes de la Sierra de El Abra dans le nord-est du Mexique, tandis que les morphes de surface résident dans les rivières, les ruisseaux et les lacs voisins (a). Chacune des trois populations de poissons cavernicoles présentait des concentrations d’hémoglobine statistiquement significativement plus élevées que le morphe de surface conspécifique (b, Chica WRS p = 0,005, Tinaja WRS p = 0,0005, Pachón WRS p = 0,0001). Les concentrations d’hémoglobine ont été mesurées par analyse spectrophotométrique (c). Aucune valeur aberrante n’a été détectée.

Une pression environnementale couramment présente dans les grottes souterraines, les niveaux d’oxygène réduits, a reçu beaucoup moins d’attention. Les environnements souterrains du monde entier ont souvent des niveaux d’oxygène réduits par rapport aux environnements terrestres environnants en raison de la respiration de l’organisme6, de l’absence d’apport photosynthétique6 et du mélange limité de l’air avec l’atmosphère de surface7. Des mesures empiriques de l’oxygène dissous ont été effectuées dans deux grottes d’El Abra, Pachón et Tinaja, qui démontrent des niveaux d’oxygène significativement plus faibles dans les bassins de grottes par rapport aux eaux de surface environnantes (OD = 2,97 mg/L dans la grotte de Pachón contre 8,20 mg/L dans l’environnement de surface (Rascón); saturation de 59 % dans la grotte de Tinaja contre 80 % de saturation dans l’environnement de surface (Nacimiento del Río Choy)8,9. Bien que cette caractéristique environnementale ait très probablement eu une incidence sur l’évolution du poisson cavernicole Astyanax, peu d’études ont abordé les caractéristiques adaptatives présumées atténuant cette pression10,11,12.

En raison des effets mondiaux du changement climatique13,14,15 et de l’impact qui en découle sur les niveaux naturels d’oxygène dissous, la tolérance à l’hypoxie a été étudiée chez plusieurs espèces de téléostéens. Les réponses complexes à l’hypoxie comprennent des changements de comportement (diminution de l’évitement des prédateurs chez les mulets gris16), des changements morphologiques (remodelage des branchies chez le carassin17) et des changements moléculaires (expression accrue du gène de détection de l’oxygène HIF-1 chez le poisson zèbre18).

Pour que suffisamment d’oxygène atteigne les tissus périphériques, les vertébrés utilisent les protéines de l’hémoglobine comme transporteurs d’oxygène. Les molécules d’hémoglobine comprennent quatre tétramères, dont chacun se lie à une seule molécule d’oxygène, chargeant quatre molécules d’oxygène par protéine d’hémoglobine. Les concentrations naturelles d’oxygène peuvent varier considérablement en fonction de l’environnement, et de nombreux animaux ont besoin de niveaux d’oxygène précis pour maintenir leurs taux métaboliques standard. Par conséquent, les gènes et les protéines de l’hémoglobine ont probablement été soumis à des changements évolutifs dans les taxons de vertébrés19. Il s’agit notamment de la variation numérique de l’organisation génomique des gènes de l’hémoglobine20, de l’augmentation de la concentration d’hémoglobine dans tambaqui21 ou de l’augmentation de l’affinité de liaison à l’hémoglobine dans le tambour rouge22. Ici, nous avons examiné la concentration d’hémoglobine car il s’agit du principal transport moléculaire pour l’administration d’oxygène23.

Nous avons identifié des changements dans les poissons des cavernes ayant un impact sur la concentration d’hémoglobine et la taille des globules rouges, qui sont probablement adaptatifs dans l’environnement de la grotte à faible teneur en oxygène. Ces altérations, qui sont absentes des morphes de surface étroitement apparentés, confèrent probablement une tolérance à l’hypoxie chez les poissons des cavernes Astyanax étant donné qu’ils ont été élevés (et persistent) dans les mêmes conditions de captivité pendant des générations. Ainsi, ce modèle offre l’occasion unique d’identifier la base génétique des changements dans le transport de l’hémoglobine et la tolérance à l’hypoxie dans la nature.

L’hémoglobine est la principale molécule de transport de l’oxygène chez presque tous les vertébrés19. Nous avons d’abord estimé que les niveaux d’hémoglobine pourraient être plus élevés dans les formes de grottes en tant qu’adaptation à la réduction de l’oxygène dans l’environnement de la grotte (par rapport aux environnements terrestres sus-jacents6) sur la base de mesures directes des grottes d’El Abra où se trouvent les poissons des cavernes Astyanax8,9. Un mécanisme adaptatif pour un faible taux d’oxygène consiste à augmenter la concentration d’hémoglobine24,25 afin d’augmenter l’oxygène disponible pour le transport systémique.

En utilisant une approche spectrophotométrique (« Matériel et méthodes »), nous avons constaté que la concentration moyenne d’hémoglobine dans les poissons de surface (n = 26) était de 8,25 ± 0,23 g/dL (Fig. 1b). Les trois populations de poissons cavernicoles examinées (Chica, Tinaja et Pachón) présentaient des concentrations moyennes d’hémoglobine significativement plus élevées que les poissons de surface (Chica n = 8, moyenne = 9,86 ± 0,43 g/dL, Wilcoxon Rank-Sum (WRS) p = 0,005; Tinaja n = 8, moyenne = 10,60 ± 0,38 g/dL, WRS p = 0,0005; Pachón n = 30, moyenne = 10,49 ± 0,39 g/dL, WRS p = 0,0001; Figue. 1b), mais ne différaient pas les uns des autres (Fig. 1b). Vraisemblablement, des concentrations d’hémoglobine plus élevées permettent aux morphes de grottes de faire face à un apport limité d’oxygène dissous dans la grotte. Cependant, diverses caractéristiques cellulaires pourraient éventuellement contribuer à une augmentation de la concentration d’hémoglobine, nous avons donc examiné les caractéristiques cellulaires des érythrocytes (c’est-à-dire les globules rouges).

L’hématocrite est la partie d’un volume sanguin donné occupée par les érythrocytes (Fig. 2a). Certains phénotypes cliniques chez l’homme, par exemple Polycythemia vera26, sont diagnostiqués en fonction de valeurs élevées d’hématocrite27,28. Par conséquent, des concentrations plus élevées d’hémoglobine chez les poissons des cavernes peuvent être dues à la présence de plus d’érythrocytes par rapport aux poissons de surface. Pour déterminer si un taux élevé d’hémoglobine est médié par une surproduction de globules rouges, nous avons comparé l’hématocrite entre les morphes de surface et de caverne.

Les tendances de l’hématocrite sont plus élevées chez les poissons des cavernes que chez les poissons de surface. La fraction de globules rouges par rapport au volume sanguin total (hématocrite) a été déterminée par centrifugation de tubes microcapillaires. La phase érythrocytaire s’accumule à l’extrémité distale du tube capillaire tandis que la couche leucocytaire et le plasma se recueillent plus près (a). Bien que la signification statistique n’ait pas été obtenue lors de la comparaison des populations individuellement (par rapport à la surface; Chica WRS p = 0,115, Tinaja WRS p = 0,018, Pachón WRS p = 0,161), une nette tendance à l’hématocrite plus élevé a été observée pour chaque population de poissons des cavernes par rapport à la surface (b). Cependant, lorsqu’on compare par morphotype (surface par rapport à tous les poissons cavernicoles), les poissons des cavernes ont un hématocrite moyen statistiquement significatif plus élevé (surface n = 8, moyenne = 28,51 ± 0,03 %, Cave n = 24, moyenne = 36,14 ± 0,01 %, WRS p = 0,024) que les poissons de surface. Une valeur aberrante (la valeur de Chica la plus faible) a été détectée, bien que la signification statistique soit restée inchangée (tableau S6).

Les mesures de l’hématocrite ont eu tendance à augmenter dans toutes les populations de grottes que nous avons examinées par rapport aux poissons de surface (Fig. 2b). Nous avons d’abord effectué une comparaison (test de la somme de rang de Wilcoxon) entre les morphes de surface et les morphes de poissons cavernicoles (indépendamment des localités individuelles de poissons cavernicoles) qui a révélé des différences significatives entre ces groupes (surface n = 8, moyenne = 28,51 ± 0,03%, grotte n = 24, moyenne = 36,14 ± 0,01%, WRS p = 0,024). Nous avons ensuite effectué une analyse post-hoc comparant chacune des quatre populations les unes aux autres. Ces résultats ont clairement démontré la même tendance, mais n’ont pas atteint la signification statistique après la correction de Bonferroni (par rapport à la surface; Chica WRS p = 0,115, Tinaja WRS p = 0,018, Pachón WRS p = 0,161, en raison de la correction de Bonferroni, les valeurs p doivent être < 0,0083 pour obtenir une signification statistique). L’hématocrite uniformément élevé chez les poissons des cavernes, cependant, n’était pas surprenant étant donné que les poissons des cavernes ont des concentrations d’hémoglobine plus élevées. Conformément aux mesures de l’hémoglobine, la population de grottes de Tinaja présentait la valeur d’hématocrite la plus élevée (hématocrite moyen = 39,23 ± 0,03%, Fig. 2b), suivie de la grotte de Pachón (hématocrite moyen = 35,56 ± 0,03%, Fig. 2b), la population de grottes de Chica présentant le plus faible hématocrite (hématocrite moyen = 33,63 ± 0,01%, Fig. 2b) des populations de grottes. Compte tenu de ces résultats, nous avons ensuite examiné la variation numérique des globules rouges pour chaque population.

Nous avons prévu que les populations de poissons des cavernes pourraient avoir une densité d’érythrocytes plus élevée que les poissons de surface, ce qui reflète des concentrations d’hémoglobine et des valeurs d’hématocrite plus élevées. De façon inattendue, les poissons de surface avaient la densité la plus élevée d’érythrocytes (n = 8, densité moyenne = 2,1 × 106 ± 1,4 × 105/mm3, Fig. 3c-c′), suivis de près par les poissons des cavernes de Pachón (n = 8, densité moyenne = 2,0 × 106 ± 8,2 × 105/mm3, Fig. 3f-f′). Fait intéressant, les poissons cavernicoles Tinaja et Chica avaient des densités moyennes légèrement inférieures (n = 8, 1,6 × 106 ± 1,8 × 105/mm3 et n = 8, 1,5 × 106 ± 6,7 × 104/mm3, Fig.3d–e′ respectivement). Bien que Chica soit statistiquement différent de Pachón (WRS p = 0,001, Fig. 3b), ces individus ont été obtenus commercialement à l’âge adulte (« Matériel et méthodes ») et leur âge précis est donc inconnu. Dans l’ensemble, les densités érythrocytaires étaient comparables entre les morphes de surface et de caverne, ce qui n’était pas prévu étant donné les concentrations d’hémoglobine et les valeurs d’hématocrite plus élevées dans les populations de grottes. Étant donné que la densité érythrocytaire était généralement réduite chez les poissons des cavernes, nous avons examiné si les différences de taille des cellules érythrocytaires pouvaient expliquer la concentration plus élevée d’hémoglobine dans les morphes des cavernes.

La densité érythrocytaire est comparable selon les morphotypes d’Astyanax. Nous avons déterminé la densité des érythrocytes dans un volume sanguin standard à l’aide d’un hémocytomètre (a). Bien qu’une différence statistique ait été détectée pour la population de Chica (p < 0,0023), la densité érythrocytaire moyenne était comparable selon les morphotypes (b). Les érythrocytes ont été colorés avec de l’orange acridine, visualisés par microscopie optique (c-f) et comptés à l’aide d’ImageJ29 (v2.0.0) (c′–f′, barre d’échelle 130 μm). Deux valeurs aberrantes ont été détectées (la valeur la plus faible en surface et la plus élevée à Chica). L’élimination de ces valeurs aberrantes a entraîné une différence statistiquement significative entre Chica et Surface (tableau S6).

Nous avons mesuré la surface érythrocytaire bidimensionnelle dans les volumes sanguins standard pour déterminer si la taille des globules rouges varie selon les populations de grottes et de surfaces. Des frottis sanguins ont été recueillis, colorés et analysés à l’aide de la microscopie optique. Les érythrocytes ont été identifiés sans ambiguïté (« Matériel et méthodes »), notés manuellement en unités de pixels (ImageJ29 v2.0.0) et convertis en μm pour une comparaison directe. Étant donné que les poissons des cavernes ont un taux élevé d’hématocrite et d’hémoglobine, mais des densités érythrocytaires comparables, nous nous attendions à ce que chaque population de grottes présente des zones érythrocytaires plus grandes. En effet, les érythrocytes des poissons de surface étaient les plus petits de toutes les populations (n = 8, surface moyenne = 71,36 ± 1,43 μm2, Fig. 4a), tandis que les érythrocytes de la population de Tinaja étaient en moyenne les plus importants des populations cavernicoles (n = 8, surface moyenne = 86,05 ± 0,96 μm2, Fig. 4c), suivis de Chica (surface moyenne = 85,70 ± 1,38 μm2, Fig. 4b) et du poisson cavernicole de Pachón (surface moyenne = 84,06 ± 1,52 μm2, Figue. 4d). Les érythrocytes des trois populations cavernicoles étaient significativement plus grands que les poissons de surface (Chica WRS p = 0,0002, Tinaja WRS p = 0,0002, Pachón WRS p = 0,0006, Fig. 4e). Cette augmentation de la taille des cellules ne s’est pas accompagnée d’une augmentation de la surface nucléaire. Pour chaque population, y compris les poissons de surface, la zone bidimensionnelle du noyau ne différait pas de plus de 0,5 μm2 (14,9 ± 0,24 μm2, Fig. 4f), ce qui suggère que les différences de zone érythrocytaire sont attribuables à l’augmentation du cytoplasme cellulaire, dans lequel l’hémoglobine est trouvée.

La surface bidimensionnelle des érythrocytes des cavernes est significativement plus grande que celle des érythrocytes de surface. Les érythrocytes de chaque population ont été colorés avec Wright-Giemsa et visualisés par microscopie optique (a-d, barre d’échelle 10 μm). L’aire bidimensionnelle totale (a–d, anneau jaune) et nucléaire (a–d, anneau bleu foncé) a été calculée pour chaque érythrocyte dans ImageJ29 (v2.0.0). La surface totale était significativement plus élevée dans toutes les populations de grottes par rapport à la surface (p < 0,00003) mais ne différait pas les unes des autres (e). Bien que la surface bidimensionnelle totale était plus élevée chez les poissons cavernicoles, il n’y avait aucune différence dans la zone bidimensionnelle des noyaux (f), ce qui suggère que les différences dans la surface bidimensionnelle totale sont dues à des différences dans le cytoplasme, où se trouve l’hémoglobine. Deux valeurs aberrantes ont été détectées (la valeur de Chica la plus élevée et la valeur de Pachón la plus faible). L’élimination de ces valeurs aberrantes n’a pas modifié la signification statistique (tableau S6).

Si les différences d’hématocrite entre les populations ne sont pas régies par un nombre accru d’érythrocytes, nous avons estimé que la variation de l’hématocrite peut être corrélée à des différences de taille des érythrocytes. Les comparaisons qualitatives semblaient démontrer cette tendance, donc pour tester cela quantitativement, nous avons effectué des corrélations pour la taille moyenne des érythrocytes et la densité érythrocytaire moyenne, par rapport à la valeur moyenne de l’hématocrite. Les mesures de la densité érythrocytaire ont montré une faible corrélation avec l’hématocrite (r = − 0,433, Fig. 5a). En revanche, la surface érythrocytaire a démontré une forte corrélation positive avec l’hématocrite (r = 0,869, Fig. 5b), suggérant que la variation de l’hématocrite élevé parmi les populations de poissons cavernicoles Astyanax est fonction de la taille des érythrocytes.

La taille des érythrocytes est positivement corrélée aux valeurs d’hématocrite chez les poissons des cavernes et des surfaces d’Astyanax. Nous avons effectué les corrélations de Pearson pour déterminer quelle caractéristique érythrocytaire (densité ou taille) est corrélée à l’hématocrite. La densité érythrocytaire moyenne n’était pas corrélée à l’hématocrite (r = − 0,4329, a). Cependant, la surface bidimensionnelle des érythrocytes de la population a fourni une forte corrélation positive avec la valeur de l’hématocrite (r = 0,8688, b).

Nous avons évalué cela plus en détail en calculant l’hémoglobine corpusculaire moyenne (MCH, « Matériel et méthodes »), une mesure qui intègre la concentration d’hémoglobine à la densité érythrocytaire pour estimer la masse d’hémoglobine dans un seul globule rouge. Conformément à d’autres résultats, la population de surface avait la valeur moyenne la plus faible de MCH (MCH moyenne = 39,41 pg, tableau 1) tandis que la population de Chica avait la plus élevée des trois populations de cavernes, suivie de Tinaja et Pachón (MCH moyenne = 66,01 pg, 65,02 pg et 52,20 pg, respectivement; Tableau 1). Ainsi, l’augmentation de la taille des érythrocytes (liée à un taux élevé d’hématocrite) contribue probablement à l’augmentation des taux d’hémoglobine dans les populations naturelles de poissons des cavernes.

Chez l’homme, les scores d’hématocrite fournissent une mesure relative du pourcentage de contribution érythrocytaire à un volume de sang donné, en raison du fait que la taille des globules rouges est stable dans la population humaine30. Les poissons des cavernes ont des niveaux plus élevés d’hémoglobine que les poissons de surface. Les niveaux d’hématocrite sont élevés chez les poissons des cavernes, mais cela est probablement une fonction des érythrocytes plus gros (plutôt que plus).

Ici, nous rapportons que les transformateurs des grottes Astyanax (provenant de trois localités cavernicoles distinctes: Chica, Pachón et Tinaja) ont développé des concentrations plus élevées d’hémoglobine sanguine par rapport aux poissons de surface étroitement apparentés. Cette hémoglobine élevée pourrait permettre aux poissons des cavernes de fournir plus d’oxygène aux tissus systémiques par unité de temps. Cela peut permettre de maintenir la respiration aérobie pendant les périodes de réduction de l’oxygène pour soutenir une activité de recherche de nourriture soutenue31,32,33,34. Compatible avec l’augmentation de l’hémoglobine, les morphes de grottes ont des scores d’hématocrite plus élevés. Bien que cela signale généralement une plus grande densité d’érythrocytes27,28, les poissons des cavernes n’avaient pas plus de globules rouges que les poissons de surface. Au contraire, la taille des érythrocytes variait selon les populations des grottes et des surfaces, les poissons des cavernes abritant uniformément une augmentation de la taille des globules rouges, ce qui explique, en partie, leurs niveaux plus élevés d’hémoglobine.

Parmi les pressions environnementales difficiles rencontrées par les poissons des cavernes, telles que l’obscurité perpétuelle et la nutrition limitée, figurent une teneur en oxygène plus faible par rapport aux eaux de surface sus-jacentes6. Il a été démontré que le manque d’oxygène affecte le comportement, la physiologie et certaines morphologies chez d’autres espèces de téléostéens16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,35. Des études futures dans notre système offrent la possibilité de comparer directement ces caractéristiques entre le morphe conspécifique « ancestral de substitution » – vivant dans des environnements bien oxygénés – aux morphes de grottes dérivés qui ont prospéré dans des eaux pauvres en oxygène pendant des dizaines à des centaines de milliers d’années2,3.

L’écart dans la taille des érythrocytes entre les populations d’Astyanax fournit au moins une explication de l’augmentation de la concentration d’hématocrite et d’hémoglobine dans les morphes des cavernes. Fait intéressant, la taille des érythrocytes varie considérablement d’une espèce de téléostéens à l’autre. Snyder et Sheafor36 ont suggéré que la variation de la taille des érythrocytes maintient une diffusion efficace de l’oxygène, mais en fonction de diamètres capillaires variables. Bien que la taille des cellules et des capillaires puisse varier d’un taxon à l’autre, la relation entre les deux reste constante. En moyenne, la largeur des érythrocytes est 25 % plus grande que le diamètre capillaire36. Fait intéressant, ils n’ont trouvé aucune relation entre la taille des érythrocytes et la capacité de transport de l’oxygène (y compris la concentration en hémoglobine), concluant ainsi que la taille des érythrocytes varie pour maintenir un flux et une diffusion efficaces.

Lay et Baldwin37 ont cherché à savoir si la taille du noyau ou l’apport d’oxygène expliquait mieux la variation de la taille des érythrocytes chez 52 espèces de téléostéens, et ont trouvé une relation inverse entre la taille des érythrocytes et la concentration d’hémoglobine. Fait intéressant, ils ont également signalé une relation inverse entre la taille des érythrocytes et la capacité de nage aérobie28,38. Plus précisément, les poissons qui nagent avec de courtes rafales de mouvement rapide ont tendance à avoir des érythrocytes plus petits, et l’augmentation de la nage aérobie était liée à un nombre plus élevé d’érythrocytes39.

Cette relation pourrait s’expliquer par le fait qu’un rapport surface/volume plus élevé dans les érythrocytes réduit la distance de diffusion de l’oxygène, ce qui permet une charge plus rapide de l’oxygène en cas de besoin37. Étant donné que le volume augmente plus rapidement que la surface et que les érythrocytes des poissons des cavernes sont plus gros que ceux des poissons de surface, les érythrocytes des poissons des cavernes ont probablement un rapport surface/volume inférieur. L’activité de morphologie des grottes a été caractérisée par une vitesse moyenne plus élevée que celle des poissons de surface34, mais les poissons de surface utilisent des mouvements rapides, courts et « éclatés »40. Étant donné que les poissons des cavernes possèdent moins d’érythrocytes mais plus gros, cela pourrait refléter leurs différents niveaux d’activité naturelle. Des résultats similaires ont été discutés par Tang et al.12 dans le contexte des différences de taille et de forme du cœur entre les morphotypes. Les poissons des cavernes possèdent des cœurs plus petits, moins triangulaires mais donc plus « spongieux » que les poissons de surface. Les cœurs plus spongieux ont un plus petit rapport entre le tissu mural compact et les trabécules, ce qui est associé à un profil d’activité sédentaire41. De plus, les cœurs avec plus de trabécules ont une plus grande surface exposée au sang circulant, ce qui permet d’augmenter les échanges gazeux qui peuvent donc offrir un avantage pour les poissons des cavernes dans des environnements hypoxiques12.

Ici, nous avons mesuré plusieurs phénotypes sanguins qui fournissent probablement un avantage adaptatif pour les poissons des cavernes Astyanax dans les grottes hypoxiques. Cependant, on ignore encore beaucoup de choses, y compris les mécanismes sous-jacents qui permettent la résistance à l’hypoxie chez cette espèce. Des études futures conçues pour caractériser les changements globaux de l’expression génique en réponse à la captivité de l’hypoxie42,43,44 pourraient révéler des gènes clés exprimés différemment ayant une incidence sur la tolérance à l’hypoxie. Par exemple, certaines populations de cichlidés indigènes du lac Victoria45,46 démontrent une expression différentielle de l’hémoglobine en fonction de l’exposition variable à l’hypoxie par les populations ancestrales. De plus, les changements de séquence codante dans les gènes de l’hémoglobine peuvent avoir un impact sur la fonction de la protéine codée, améliorant peut-être la capacité de liaison de l’oxygène dans les niveaux d’oxygène ambiant variables au cours de l’évolution20.

Un nombre considérable de recherches a identifié des dizaines de réponses adaptatives à l’hypoxie chez les téléostéens47. D’autres adaptations d’Astyanax peuvent inclure des changements dans l’anatomie et la fonction des branchies. Par exemple, Moran et al.11 ont noté que les branchies des cavernes de Pachón sont plus lourdes que les morphes de surface, et que la masse moyenne des branchies des hybrides Pachón/F2 de surface était supérieure à la population de surface parentale. Cela peut indiquer une sélection positive survenant à la suite d’une hypoxie dans des grottes11. Le carassin peut « remodeler » ses branchies pour améliorer l’échange d’oxygène et limiter les échanges d’ions inutiles et énergétiquement coûteux17,48. Il est concevable que des altérations similaires de la morphologie des branchies puissent fournir une absorption plus efficace de l’oxygène et une conservation de l’énergie dans les grottes hypoxiques.

Enfin, en plus de l’évolution des caractéristiques régressives (p. ex., la perte oculaire), de nombreux traits sensoriels non visuels constructifs ont évolué chez les poissons des cavernes, tels que les expansions de la ligne latérale49,50 et des systèmes gustatifs51,52. Une modalité sensorielle non examinée dans Astyanax est la détection d’oxygène. Les cellules neuroépithéliales (NEC) sont les principales cellules sensibles à l’oxygène chez les poissons et sont réparties dans une fine couche épithéliale dans les filaments branchiaux et les lamelles, couvrant l’aspect efférent des branchies53. En raison du positionnement de ces cellules, elles peuvent jouer un rôle dans la détection des changements externes (eau ambiante) et internes (artériole) de la pression partielle de l’oxygène53. De plus, ces cellules sont homologues aux chimiorécepteurs de type I situés dans le corps carotidien des mammifères54. Les principales différences dans l’expression des NEC dans les canaux ioniques contribuent à la tolérance à l’oxygène chez les poissons rouges résistants à l’anoxie55. Étant donné que d’autres systèmes sensoriels sont augmentés en conséquence de la vie dans l’environnement extrême de la grotte, des altérations similaires dans la détection de l’oxygène peuvent avoir évolué de manière similaire pour faire face à des conditions d’oxygène réduites.

Tous les animaux utilisés dans cette étude ont été maintenus dans une installation aquatique satellite de l’Université de Cincinnati et logés dans des réservoirs de 5 ou 10 gallons dans une unité d’élevage personnalisée à osmose inverse avec plusieurs filtres (filtres à charbon, microns, UV et particules denses; Aquaneering, San Diego, Californie). Ce système conditionne l’eau à une température de 24 ° (± 2 ° C), un pH de 7,4 (± 0,2) et une conductivité de 750 μS / cm (± 50 μS / cm) en utilisant la surveillance de dose en temps réel. Les populations des grottes d’Astyanax (Pachón, Tinaja et Chica) et les morphes de surface ont été logés sous 12 h: 12 h de cycle lumière: obscurité et nourris une fois par jour (~ 9h00) avec un mélange de nourriture en flocons secs (TetraMin Pro) et d’eau du système. Les poissons de surface, les poissons des cavernes Tinaja et Pachón utilisés dans cette étude proviennent de spécimens adultes reproducteurs d’Astyanax mexicanus fournis à l’origine par le Dr Richard Borowsky. Les poissons cavernicoles chica ont été acquis commercialement et, par conséquent, l’âge précis de ces individus est inconnu. Certains paramètres sanguins, y compris l’hématocrite, peuvent changer avec l’âge chez l’homme, nous avons donc minimisé la variation biologique dans cette étude en excluant les poissons < 40 mm de longueur standard. Les mesures de longueur standard n’ont pas été enregistrées pour chaque individu, bien que chaque individu ait dépassé 40 mm de longueur standard.

Les animaux ont été anesthésiés à l’aide d’eau glacée et le sang a été recueilli via la veine caudale à l’aide d’une seringue 31G (BD Ultra-Fine™, BD Biosciences, San Jose, CA). Nous avons utilisé des poissons d’âge et de longueur standard comparables dans toutes les populations et avons constaté qu’aucun des deux facteurs n’avait d’impact significatif sur le score phénotypique dans cette étude (tableaux supplémentaires S1 à S4). Les collectes ont eu lieu entre 12h00 et 17h00 afin de minimiser les effets potentiels de diel. Toutes les conditions de logement et les méthodes de collecte ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Cincinnati (protocole IACUC # 10-01-21-01).

Les concentrations d’hémoglobine ont été mesurées à l’aide d’un hémoglobinomètre Aimstrip (Germaine Laboratories, San Antonio, TX, États-Unis). Le compteur a été étalonné et vérifié optiquement avant chaque utilisation conformément aux instructions du fabricant. 10 μL de sang total ont été placés sur une bandelette réactive (Fig. 1c) et insérés dans le compteur d’hémoglobine. Les concentrations ont été calculées automatiquement par spectrophotométrie et affichées en g/dL.

Les valeurs d’hématocrite ont été mesurées par centrifugation à l’aide d’une centrifugeuse LW Scientific ZipCombo (LW Scientific, Lawrenceville, GA) équipée d’un rotor microhématocrite de 12 places. Le sang total a été recueilli dans un tube capillaire et scellé à l’extrémité opposée avec de l’argile. Chaque tube capillaire a été filé pendant 3 minutes à 12 000 tr/min, conformément aux recommandations du fabricant. Les composants sanguins ont été séparés en phases: les érythrocytes beaucoup plus nombreux et plus gros s’accumulent dans la phase inférieure, tandis que la couche leucocytaire (principalement les globules blancs et les plaquettes) et la couche de plasma sanguin au-dessus des érythrocytes (Fig. 2a). La longueur de la phase érythrocytaire et la longueur du volume sanguin total ont été mesurées. La fraction hématocrite a été déterminée en divisant la longueur de la phase érythrocytaire par le volume sanguin total.

Pour déterminer la densité des érythrocytes pour chaque population, un hémocytomètre Neubauer amélioré (Hausser Scientific, Horsham, PA) a été utilisé (Fig. 3a). 1 μL de sang total a été dilué dans une solution de coloration de 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (1×) et 20 μL d’une solution de travail de la coloration nucléaire Acridine Orange (A1301, Invitrogen par Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Cette dilution a été incubée à température ambiante pendant 20 min. Après l’incubation, 10 μL ont été placés sur l’hémocytomètre et visualisés à l’aide d’un microscope composé LED Leica DM2000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne). Les images ont été capturées avec un appareil photo Leica DMC4500 monté sur le microscope et le logiciel Leica Application Suite (LAS) X (version 3.0.1.15878).

L’hémocytomètre est équipé de gravures en grille complexes (Fig. 3a) pour permettre une méthode précise de comptage du nombre de cellules dans une zone précise. La plus grande surface carrée visible utilisant notre oscilloscope composé était de 0,75 mm × 0,75 mm ou 0,5625 mm2. Trois zones différentes de 0,5625 mm2 ont été comptées et moyennées pour chaque individu.

Pour estimer le volume total, l’hémocytomètre a été conçu de manière à ce que les épaules de chaque côté de la plate-forme supportent un glissement de couvercle exactement 0,1 mm au-dessus de la plate-forme. Ainsi, le volume total dans cette section est de 0,05625 mm3. Le comptage des cellules a été effectué à l’aide d’ImageJ29 (v2.0.0) en utilisant d’abord l’outil « Seuil de couleur ». Le seuil a été ajusté manuellement pour chaque image afin d’éliminer les artefacts optiques. La zone carrée a ensuite été sélectionnée et le comptage a été effectué à l’aide de l’outil « Analyser les particules ». Ces outils permettent d’exclure la taille pour s’assurer que les artefacts ne sont pas comptés. Les érythrocytes sont beaucoup plus gros que les globules blancs, nous avons donc exclu les caractéristiques inférieures à 30 μm2. Nous avons calculé le nombre de cellules par 1 mm3 (c.-à-d. la densité cellulaire) en divisant le nombre de cellules brutes par le volume (0,05625 mm3) et en multipliant par le facteur de dilution (520).

7,5 μL de sang total ont été appliqués sur une lame de microscope, étalés, séchés à l’air et colorés à l’aide de Wright-Giemsa, colorant modifié selon les instructions du fabricant (WG16, Millipore Sigma, Burlington, MA, États-Unis). Neuf cellules ont été sélectionnées au hasard et mesurées manuellement et moyennées pour chaque individu. L’orientation de chaque cellule sélectionnée était parallèle à la lame (le diamètre de cellule court et long à la longueur maximale), ne touchant pas une autre cellule et exempte de déformation évidente. Toutes les cellules ont été imagées et mesurées à l’aide des outils « Sélection de polygones » et « Mesure » d’ImageJ29. Les pixels ont été convertis en μm pour chaque image à l’aide de la barre d’échelle imagée (LAS X) pendant la microscopie et des outils « Ligne droite » et « Définir l’échelle » dans ImageJ29. La surface nucléaire de chaque érythrocyte a été mesurée à l’aide du protocole identique utilisé pour mesurer la surface bidimensionnelle totale, comme décrit ci-dessus.

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées dans R56 (version 3.6.1) à l’aide des paquets de base 'stats'56 et 'Rmisc'57. Au moins huit individus de chaque population ont été utilisés pour chaque essai, car il s’agissait du plus grand nombre de personnes admissibles de la plus petite population en laboratoire. La mise en aveugle a été incorporée dans la mesure du possible par un enquêteur qui a recueilli des données (cellules d’imagerie), créé une clé d’identification et supprimé la nomenclature individuelle avant qu’un deuxième chercheur ne quantifie et ne retourne les données à l’enquêteur. Les tests de somme de rang de Wilcoxon (WRS) ont été utilisés pour détecter la signification statistique des concentrations d’hémoglobine, de l’hématocrite, de la densité érythrocytaire et de la taille des érythrocytes. Toutes les valeurs p pour ces tests ont été corrigées par Bonferroni pour des comparaisons multiples. La signification statistique a été obtenue si p < 0,0083. Les corrélations de Pearson ont été calculées en R56 à l’aide du paquet de base 'stats'56. La normalité a été testée pour chaque population dans chaque essai à l’aide du test de normalité de Shapiro-Wilk. Toutes les populations ont suivi la distribution normale, à l’exception des mesures de la zone nucléaire de Pachón 2d (tableau S5). Une analyse supplémentaire a été effectuée pour tester la présence de valeurs aberrantes. Nous avons testé toutes les populations dans chaque essai à l’aide du filtre Hampel58. Ce test a toutefois détecté des valeurs aberrantes, mais l’élimination des valeurs aberrantes n’a affecté qu’une seule signification statistique (Fig. 3b, tableau S6.). Toutes les données recueillies (y compris les valeurs aberrantes) sont présentées dans ce manuscrit. Les poissons mâles et femelles ont été inclus dans tous les essais. Le sexe ne semble pas être un facteur biologique dans les paramètres sanguins que nous avons examinés, d’après les analyses de la somme de rang de Wilcoxon (n = 42 pour la concentration d’hémoglobine et n = 32 pour l’hématocrite, la densité érythrocytaire et les mesures de surface 2d, chaque morphe inclus) pour chaque essai (tableaux supplémentaires S1 à S4). L’hémoglobine corpusculaire moyenne (HME) estime la masse de protéine d’hémoglobine par érythrocyte. Cette valeur est calculée en divisant le nombre de grammes d’hémoglobine par litre par le nombre de globules rouges en millions par millilitre fournissant des picogrammes d’hémoglobine par globule rouge59. Les nuages de points ont été créés dans R56 à l’aide du paquet 'ggpubr'60. Les boxplots ont été créés dans R56 en utilisant le paquet 'ggplot2'61. Dans ces diagrammes, les moustaches s’étendent jusqu’à la plus petite ou la plus grande valeur ne dépassant pas 1,5xIQR et les lignes horizontales représentent les premier et troisième quartiles et la médiane. Toutes les images ont été modifiées dans Microsoft PowerPoint (version 16.23).

Le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Cincinnati (protocole IACUC # 10-01-21-01) a approuvé toutes les conditions de logement et les méthodes de collecte pour l’utilisation d’Astyanax mexicanus dans cette étude. De plus, cette étude était conforme aux principes énoncés dans la Déclaration de Bâle et les lignes directrices ARRIVE.

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles dans la section Informations supplémentaires.

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Les auteurs souhaitent remercier les membres du laboratoire Gross, actuels et anciens, pour leurs discussions utiles concernant ce projet et leur aide en matière de pisciculture, en particulier Daniel Berning et Alyssa Hamm.

Département des sciences biologiques, Université de Cincinnati, Cincinnati, OH, 45221, États-Unis

Tyler E. Boggs, Jessica S. Friedman et Joshua B. Gross

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T.E.B. et J.B.G. ont conçu des expériences, T.E.B. et J.S.F. ont réalisé des expériences, T.E.B. et J.B.G. ont analysé les données et T.E.B. et J.B.G. ont écrit le texte principal. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit final.

Correspondance avec Joshua B. Gross.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Boggs, T.E., Friedman, J.S. & Gross, J.B. Les altérations des globules rouges des poissons des cavernes fournissent des preuves d’adaptation à la réduction de l’oxygène souterrain. Sci Rep 12, 3735 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-07619-0

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Reçu: 19 novembre 2021

Acceptée : 15 février 2022

Publication : 8 mars 2022

DEUX : https://doi.org/10.1038/s41598-022-07619-0

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